Придворная Знаменская церковь была заложена по повелению Цесаревны Елизаветы Петровны 13 Мая 1734 г. недалеко от дворца, на месте сгоревшей в 1728 г. Благовещенской церкви, в присутствии самой Цесаревны и множества гостей.
Церковь строилась по проекту архитектора Михаила Григорьевича Земцова, наблюдение за строительными работами вёл его ближайший помощник Иван Яковлевич Бланк. Первоначально церковь имела четыре придела. Главный придел — во имя иконы Божией Матери Знамение был освящён полным чином лишь по завершении отделки храма, которая продолжалась довольно долго и была окончена лишь в 1747 году. Правый придел св. великомученицы Екатерины был освящён намного раньше — 6 Июня 1736 года. Левый придел свв. прав. Захария и Елизаветы освящён, по всей видимости, в эти же годы. Ещё один, верхний придел Свт. Николая Чудотворца, находившийся на хорах, был освящён 6 Июня 1736 года, одновременно с приделом св. великомученицы Екатерины. Согласно архивным документам, происходившие в храме многократные освящения приделов (до завершения его полной отделки) были вызваны продолжавшимися работами по устройству и украшению иконостосов, переписки икон и т. п.4
Перед началом Великой Отечественной войны Знаменская церковь оставалась единственной действующей в Царском Селе, и даже во время оккупации в ней продолжали совершаться Богослужения. С Марта 1938 г. на протяжении четырёх лет её настоятелем являлся протоиерей Феодор Феодорович Забелин (1868–1949), в Августе 1942 г. эвакуированный в г. Гатчину, которого на этом посту сменил протоиерей Иоанн Лаврентьевич Коляденко (1873–...). В Октябре 1942 г. утварь Знаменской церкви была перенесена во дворец Кочубея в Софию, где, с этого времени и стала совершаться Божественная литургия.
Судя по всему, Богослужения в Царском Селе прекратились уже в 1943 г. О судьбе протоиерей Иоанна Коляденко, служившего в эти годы одновременно и в нескольких павловских
храмах, с Сентября 1944 г. ничего не известно. Перед отступлением немецкими захватчиками из храма были похищены большинство оставшихся в ней икон и церковной утвари, однако само здание в целом не пострадало, внутри даже сохранился иконостас без икон14 (о судьбе иконы Божией Матери «Знамение» подробнее см. Приложение VI в конце книги). В Июле 1944 г. группа жителей г. Пушкина образовала инициативную группу и направило ходатайство митрополиту Алексию (Симанскому) с просьбой посодействовать открытию храма, однако, как явствует из архивных документов, в Октябре 1946 г. Ленгорсовет отклонил это ходатайство (направленное следом ещё одно ходатайство тоже было отклонено 4 Апреля 1947 г.). Территория Лицейского садика, вокруг Знаменской церкви, была превращена в кладбище, на котором были захоронены как немецкие солдаты, так и местные жители, скончавшиеся в годы войны.
С 1946 г. на протяжении десяти лет Знаменская церковь находилась в ведении Центрального Хранилища Музейных фондов и использовалась под хранилище книжного фонда.
В 1960–1962 годах церковь была отреставрирована, шпиль колокольни, видоизменённый в XIX веке, был в 1960 г. восстановлен в первоначальном виде архитектором Михаилом Михайловичем Плотниковым. Вплоть до начала 1990-х годов в Знаменской церкви размещалась контора 2-й мастерской объединения «Реставратор», находившаяся в ведении Екатерининского дворца музея.
В 1991 г. Знаменская церковь, после многочисленных ходатайств, была возвращена Русской Православной Церкви, и 10 Декабря 1991 г. (в день престольного праздника) была открыта для Богослужений. После проведённого в 1995–1999 годах реставрации внутреннего убранства и завершившейся к осени 2005 г. реставрации фасадов Знаменская церковь приятно радует глаз как своих прихожан, так и гостей Царского Села, впервые её увидевших. Указом Президента Российской Федерации от 20 Марта 1995 г. Знаменская церковь была включена в число объектов исторического и культурного наследия, как памятник архитектуры федерального значения.